两种方法培养大鼠破骨细胞的噬骨能力比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.20.001

摘要/Abstract

摘要：

背景：原代培养的破骨细胞数量少，而诱导培养产生的破骨样细胞数量多，能够满足一些研究骨代谢实验的要求。但是两种细胞在特异酶及噬骨能力方面是否具有相同的效果，到目前为止，还没有详尽的数据来支持。
目的：比较大鼠原代分离的破骨细胞及诱导形成的破骨样细胞噬骨能力上的差异。
方法：取24 h内新生Wistar大鼠四肢长骨，酶消化法分离培养破骨细胞，将破骨细胞培养过程中消化下来的骨髓单核细胞加入1,25(OH)₂D₃诱导生成破骨样细胞。苏木精-伊红染色、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鉴定。用甲苯胺蓝染色共培养骨片比较两组破骨细胞噬骨能力。
结果与结论：诱导第9天，破骨样细胞数目为破骨细胞数目的11倍，其形态与原代消化获得的细胞形态相同。抗酒石酸酸性磷酸酶染色呈阳性。甲苯胺蓝染色显示两组破骨细胞在骨片上培养时产生骨陷凹面积及深度差异无显著性意义。结果显示破骨样细胞的形态、特异酶及噬骨能力与破骨细胞无差异。

关键词: 组织构建, 骨组织构建, 破骨细胞, 培养, 诱导, 鉴定, 噬骨, 1,25(OH)₂D₃, 破骨样细胞, 单核细胞, Wistar大鼠

Abstract:

BACKGROUND: There are less primary cultured osteoclasts, but a large number of osteoclast-like cells produced by induced culture, which is able to meet the requirements of some experimental studies of bone metabolism. But there are no detailed data to identify whether the osteoclasts and osteoclast-like cells have the similar effect on specific enzymes and bone absorption capacity.
OBJECTIVE: To compare the difference of bone absorption ability between the primary cultured osteoclasts and induce cultured osteoclast-like cells from the rats.
METHODS: The long bones were obtained from the limbs of 24 hours newborn Wistar rates, and the enzyme digestion was used to isolate and culture osteoclasts; then bone marrow mononuclear cells separated from the osteoclasts during culture were added with 1,25(OH)₂D₃ to induce to generate the osteoclast-like cells. The cells were identified with heamtoxylin-eosin staining and tartrate-resistant acid phosphatase staining. The bone absorption ability of the osteoclasts in two groups was compared with toluidine blue staining.
RESULTS AND CONCLUSION: The number of the osteoclast-like cells was 11 times that of osteoclasts at 9 days after induction. The morphology of osteoclast-like cells was similar with that of the primary cultured osteoclasts. The osteoclast-like cells were positive for tartrate-resistant acid phosphatase. Toluidine blue staining results showed there was no significant difference in bone lacuna area and depth produced by the osteoclasts cultured on the bone slices between two groups. These findings show that there are no significant differences in morphology, specific enzymes and bone absorption capacity between osteoclast-like cells and osteoclasts.

Key words: tissue construction, bone tissue construction, osteoclasts, culture, induction, identification, bone absorption, 1,25(OH)₂D₃, osteoclast-like cells, mononuclear cells, Wistar rats

中图分类号:

R318

王正东，颜南，潘峰，杨芳莉，刘自力，姜海波，臧晋，牟军，柏树令. 两种方法培养大鼠破骨细胞的噬骨能力比较[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(20): 3611-3617.

Wang Zheng-dong,Yan Nan, Pan Feng, Yang Fang-li, Liu Zhi-li, Jiang Hai-bo, Zang Jin, Mu Jun, Bai Shu-ling. Comparison of bone absorption capacity of rat osteoclasts cultured by two methods [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(20): 3611-3617.

图/表（结果） 6

2.1 成熟破骨细胞的分离培养及纯化结果 倒置相差显微镜下观察从骨干上分离培养的细胞中，破骨细胞数量较少，破骨细胞混杂在大量的单核细胞中，经过24 h的培养，细胞均贴壁生长，其中破骨细胞的贴壁能力最强，用0.05%胰蛋白酶-0.02% EDTA联合作用5 min后，大部分单核细胞脱落，培养板上大部分细胞为多核巨细胞，在100倍倒置相差显微镜下单个视野平均可计数5个破骨细胞左右。纯化率达80%。成熟破骨细胞体积大，核多，胞浆丰满，细胞突起延展。细胞核数目不一，圆形或椭圆形，有的积聚在细胞中央，有的排列在细胞周边，见图1。

2.2 1，25(OH)₂D₃诱导破骨样细胞的生成 将洗涤下的单核细胞接种于培养板后，培养一段时间后，取出细胞玻片，进行TRAP染色，偶见或不见TRAP阳性细胞，说明洗涤下的细胞绝大部分为单核细胞，混合的破骨细胞极少。在100倍相差显微镜下，随机取5个视野计数多核(≥3个)的细胞数目，加入1，25(OH)₂D₃诱导第3天左右在单核细胞中开始有多核细胞生成，破骨样细胞体积大，多核，见图2，3。苏木精-伊红染色可见诱导形成细胞为多核的破骨样细胞，见图4，多核细胞TRAP染色阳性，见图5。到诱导第9天多核巨细胞数量达到高峰，高峰时同期破骨样细胞数目为破骨细胞数目的11倍，见图6。

2.3 骨吸收陷窝定量分析 光镜下，经甲苯胺蓝染色的破骨细胞在骨片上形成的吸收陷窝呈紫色或蓝紫色，培养3 d的骨片上可偶见着色较淡的吸收陷窝，呈圆形或椭圆形；6 d时有腊肠形吸收陷窝出现；9 d后吸收陷窝绝大部分呈梅花瓣形或腊肠形，边界轮廓清晰，陷窝底部纤维纹路隐约可见，见图7。

2.3.1 骨片吸收陷窝计数 从图8可以看出，随着时间的增加破骨细胞吸收陷窝数目(10个100倍视野下吸收陷窝的总和)没有明显增加，破骨样细胞吸收陷窝数目随时间的增加而增加。

2.3.2 吸收陷窝面积分析 从图9可以看出，随着培养时间的延长，破骨细胞与破骨样细胞陷窝面积逐渐扩大，在3，6，9 d时，同期破骨细胞与破骨样细胞之间经双侧t 检验分析，P > 0.05，说明两组间单个吸收陷窝面积差异无显著性意义。

2.3.3 吸收陷窝深度分析 从图10可以看出，随着培养时间的延长，破骨细胞与破骨样细胞陷窝深度逐渐扩大，在3，6，9 d时，同期破骨细胞与破骨样细胞之间经双侧t 检验分析，P > 0.05，说明两组间单个吸收陷窝深度差异无显著性意义。

参考文献

[1] Chambers TJ, Magnus CJ. Calcitonin alters behaviour of isolated osteoclasts. J Pathol. 1982;136(1):27-39.

[2] Wang ZD,Yan N, Li WH,et al. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2007;11 (19) :3698-3700.王正东,颜南,李文海,等.新生鼠股骨破骨细胞存在位置的确定及其噬骨能力验证[J]．中国组织工程研究与临床康复,2007,11 (19) :3698-3700.

[3] Testa NG, Allen TD, Lajtha LG,et al. Generation of osteoclasts in vitro. J Cell Sci. 1981;47:127-137.

[4] Balani D, Aeberli D, Hofstetter W,et al. Interleukin-17A stimulates granulocyte-macrophage colony-stimulating factor release by murine osteoblasts in the presence of 1,25-dihydroxyvitamin D(3) and inhibits murine osteoclast development in vitro. Arthritis Rheum. 2013;65(2):436-446.

[5] Tohmonda T, Yoda M, Mizuochi H,et al. The IRE1α-XBP1 pathway positively regulates parathyroid hormone (PTH)/PTH-related peptide receptor expression and is involved in pth-induced osteoclastogenesis. J Biol Chem. 2013;288(3):1691-1695.

[6] Yan N,Wang ZD,Jin Y,et al. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2008;12 (20) : 3818-3821.颜南,王正东,金韵,等.异丙肾上腺素对大鼠骨髓单核细胞向破骨细胞转化的影响[J]. 中国组织工程研究与临床康复,2008,12 (20):3818-3821.

[7] Garcia-Palacios V, Chung HY, Choi SJ,et al. Eosinophil chemotactic factor-L (ECF-L) enhances osteoclast formation by increasing in osteoclast precursors expression of LFA-1 and ICAM-1. Bone. 2007;40(2):316-322.

[8] Cai LM,Wang ZD,Yan N. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2007;11 (28) : 5485-5487.柴立民,王正东,颜南.不同体积分数血清对培养原代破骨细胞噬骨能力的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11 (28) : 5485-5487.

[9] Wang ZD,Bai SL,Fan J. Jiepouxue Zazhi. 2008;31(2): 148-150.王正东,柏树令,范军. 1, 25二羟基胆钙化醇诱导大鼠骨髓单核细胞向破骨细胞转化的机制[J].解剖学杂志,2008,31(2): 148-150.

[10] Gao JJ,Jin WF,Wang HF. Shanghai Yike Daxue Xuebao. 1998;25(1):71-73.高建军,金慰芳,王洪复. 骨片吸收陷窝光镜计数法定量测定破骨细胞功能[J].上海医科大学学报,1998,25(1):71-73.

[11] Asai M, Lee JW, Itakura Y,et al. Effects of veraguensin and galgravin on osteoclast differentiation and function. Cytotechnology. 2012;64(3):315-322.

[12] de Moraes M, de Matos FR, de Souza LB,et al. Immunoexpression of RANK, RANKL, OPG, VEGF, and vWF in radicular and dentigerous cysts. J Oral Pathol Med. 2012. [Epub ahead of print]

[13] Giganti MG, Liuni F, Celi M,et al. Changes in serum levels of TNF-alpha, IL-6, OPG, RANKL and their correlation with radiographic and clinical assessment in fragility fractures and high energy fractures. J Biol Regul Homeost Agents. 2012; 26(4):671-680.

[14] Lacey DL, Boyle WJ, Simonet WS,et al. Bench to bedside: elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab. Nat Rev Drug Discov. 2012; 11(5):401-419.

[15] Hanada R, Leibbrandt A, Hanada T,et al. Central control of fever and female body temperature by RANKL/RANK. Nature. 2009;462(7272):505-509.

[16] Wade-Gueye NM, Boudiffa M, Vanden-Bossche A,et al. Absence of bone sialoprotein (BSP) impairs primary bone formation and resorption: the marrow ablation model under PTH challenge. Bone. 2012;50(5):1064-1073.

[17] Kitazawa R, Mori K, Yamaguchi A,et al. Modulation of mouse RANKL gene expression by Runx2 and vitamin D3. J Cell Biochem. 2008;105(5):1289-1297.

[18] Nerenz RD, Martowicz ML, Pike JW. An enhancer 20 kilobases upstream of the human receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand gene mediates dominant activation by 1,25-dihydroxyvitamin D3. Mol Endocrinol. 2008;22(5): 1044-1056.

[19] Yamashita T, Takahashi N, Udagawa N. New roles of osteoblasts involved in osteoclast differentiation. World J Orthop. 2012;3(11):175-181.

[20] Dorotheou D, Gkantidis N, Karamolegkou M,et al. Tooth eruption: altered gene expression in the dental follicle of patients with cleidocranial dysplasia. Orthod Craniofac Res. 2013;16(1):20-27.

[21] Wang BL,Liang H,Zheng F,et al. Shengli Xuebao. 2007;59(2): 169-174.王宝利,梁晖,郑纺,等.重组可溶性核因子κB受体活化因子体外抑制甲状旁腺激素诱导的破骨细胞生成[J]. 生理学报,2007, 59(2):169-174.

[22] Xu DR,Yu XQ,Fang BQ. Zhonghua Shenzhangbing Zazhi. 2005 ;21(4):186-190.许多荣,余学清,方荸荠.甲状旁腺激素在体外对破骨细胞分化及骨重吸收能力的影响[J].中华肾脏病杂志,2005 ,21(4):186-190.

[23] Wang XM,Yu SF,Yang ZP. Beijing Daxue Xuebao:Yixueban. 2000;32(4):358-361.王晓敏,于世凤,杨宗萍.白细胞介素-4对破骨细胞的分化作用[J].北京大学学报:医学版,2000,32(4):358-361.

[24] Zhang R. Shijiazhuang:Hebei Medical University. 2011.张睿. M-CSF、RANKL和1,25-(OH)2D3对破骨细胞形成分化影响的比较研究[D].石家庄:河北医科大学,2011.

[25] Zhang K,Chen XL,Wang DC,et al. Zhongguo Guzhi Shusong Zazhi. 2006;12(6): 561-565.张鲲,陈晓亮,王德春,等.两种方法培养大鼠破骨细胞的比较研究[J].中国骨质疏松杂志,2006,12(6): 561-565.

引言

材料方法

设计：横断面研究。

时间及地点：实验于2011年6月在沈阳医学院中心实验室完成。

材料：

实验动物：新生24 h Wistar大鼠，雌雄不限，由沈阳医学院动物部提供。

实验所用主要试剂：DMEM培养基(Gibco)；胎牛血清(天津灏洋)；胰蛋白酶、EDTA、萘酚AS-BI磷酸钠、酒石酸甲钠、1，25(OH)₂D₃(Sigma)。

实验方法：

薄骨片的制备及处理：取成年新鲜牛股骨皮质，先用钢锯锯成2 cm宽条，然后用磨片机磨成厚度60 μm，大小为1 cm×1 cm的骨片，置于蒸馏水中清洗多次，取出后再放于体积分数为75%乙醇中浸泡48 h，自然晾干。在消毒的超净台内，平铺骨片，紫外线灯直接照射消毒，半个小时后翻另一面照射消毒，然后放于滤过的DMEM培养液中浸泡，于4 ℃密封放置备用。

破骨细胞分离、培养及纯化：麻醉后将24 h内新生大鼠断颈处死，放于体积分数为75%乙醇中浸泡片刻，去除皮肤、肌肉等软组织，无菌条件下取下四肢长骨，在无菌PBS中反复冲洗去净附着在骨表面的软组织(尽可能去除所有组织)。在DMEM培养基(含体积分数为15%胎牛血清^[8]，4 μmol/L谷氨酰胺)中去除干骺端，然后将其骨干纵行剖开，刮骨髓腔内表面直至骨干变成极为微小的碎片，用300目筛网滤过，用吸管多次反复轻吹洗筛网上残渣，吸取滤过悬液于离心管内，4 ℃ 1 000 r/min离心 10 min，弃上清，加4 mL DMEM培养液吹打均匀(含细胞数约为1×10⁵)，接种于24孔板中，其中24孔板内分别置 1 cm×1 cm玻片和骨片，其中一骨片板孔放无细胞的DMEM培养液作为对照，置37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱孵育24 h。轻吸培养板中的培养液于离心管中，用PBS冲洗2遍，洗涤下的液体同样放于上述离心管内。0.05%胰蛋白酶-0.02% EDTA联合消化培养板中的细胞 6 min，将消化下来的细胞也置入离心管中。PBS冲洗培养皿两三次，然后加入含体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养液终止胰蛋白酶的消化作用。将培养板置于倒置相差显微镜下观察，如残留较多单核细胞可重复上述所有操作(单个视野内单核细胞数量占30%或者30%以上为残留较多的单核细胞)。将上述处理后的培养板置37 ℃，体积分数为5% CO₂培养箱内培养，即为原代组，隔日换液。

维生素D代谢物1，25-二羟维生素D₃[1,25-(OH)₂D₃]诱导破骨样细胞的生成：将上述消化下来的单核细胞收集于离心管中，在4 ℃ 1 000 r/min下离心10 min，弃上清，加适量DMEM培养基，调整细胞浓度为2×10⁹ L^-1左右，将细胞接种于置1 cm×1 cm玻片和骨片的24孔板中，使细胞接种密度为2×10⁶/cm²。在24孔中加入1，25(OH)₂D₃使其终浓度为10^-8 mol/L^[9]，即为诱导组。将培养板置 37 ℃，体积分数为5% CO₂培养箱内。隔日换液。

破骨细胞形态观察：分别在第3，6，9，11天时，在倒置显微镜下对培养的细胞进行活体观察，并计数不同培养时间多核细胞(≥3个)数量，取细胞玻片经苏木精-伊红染色后在显微镜下观察细胞形态。

对细胞行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色：孵育液 A液为0.1 mol/L醋酸缓冲液；B液为六偶氮副品红；C液为取萘酚AS-BI磷酸酯加入 N，N-二甲基甲酰胺溶解。将 A、B、C三液按比例混匀，调pH至5.0，加入酒石酸钾钠配成TRAP孵育液(对照组孵育液不含萘酚 AS-BI磷酸钠)。在玻片上培养9 d的破骨细胞经2.5%戊二醛 4 ℃固定1 min后，放入孵育液内，37 ℃孵育50 min，1%甲苯胺蓝复染，甘油明胶封固，光镜下观察。

破骨细胞在骨片上形成的骨吸收陷窝定量分析：

破骨细胞在骨片上形成的骨片吸收陷窝计数：参考高建军等^[10]方法分别于3，6，9 d取出原代组和诱导组培养板中的骨片各4张，2.5%戊二醛固定7 min，于 0.25 mol/L氢氧化铵中超声波清洗3次，每次5 min，在系列梯度乙醇中脱水，自然凉干1 min，室温在1%甲苯胺蓝染液中染色三四分钟，蒸馏水清洗3次，在100倍光学纤维镜下对每张骨片5个不同视野上的吸收陷窝计数。

破骨细胞在骨片上形成的吸收陷窝面积分析：以上各组经甲苯胺蓝染色骨片于400倍光镜下随机选取5个视野拍摄照片，采用计算机Meta Morph /Dp10 /Bx41分析系统勾画出骨陷窝轮廓，计算并比较各组陷窝面积。

破骨细胞在骨片上形成的吸收陷窝深度分析：经甲苯胺蓝染色骨片于400倍光镜下随机选取5个视野拍摄照片，由于陷窝着色深浅与其深度有关，采用计算机MetaMorph/Dp10/Bx41分析系统分析计算骨片上陷窝染色的平均吸光度值，并以此比较各组陷窝深度的差异。

统计学分析：结果以x(_)±s表示，所有数据采用SPSS 11.0软件进行，多组比较用one way ANOVA 方差分析，组间比较用q 检验；两组比较用t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

破骨细胞属单核/巨噬细胞谱系细胞，已经广泛被人们所共识，它由多种参与基本调控的细胞因子通过直接或间接刺激作用单核细胞，接受作用的单核细胞经过增殖、分化、生存等过程最终融合发育为多核的成熟破骨细胞，最后被活化而具有噬骨能力^[11]。新近发现的核因子κB受体活化因子配体(RANKL)/核因子κB受体活化因子(RANK)/护骨素(OPG)细胞因子系统提高了对破骨细胞生物学和骨稳态分子水平的认识^[12-13]。核因子κB受体活化因子配体与核因子κB受体活化因子之间的相互作用决定了破骨细胞的分化^[14-15]。众多因子如PTH1α^[16]、1,25(OH)₂D₃^[17-18]、白细胞介素等也直接作用于成骨细胞^[19-20]，调节这细胞因子系统的浓度增加与减少，进而间接地完成它们的调节功能。王宝利等^[21]构建sRANK的原核表达载体，转化入大肠杆菌表达菌株Origami B (DE3)，成功表达了重组蛋白，亲和层析进行纯化。重组sRANK以剂量依赖方式抑制由甲状旁腺激素诱导的破骨细胞生成和骨吸收陷窝形成。RT-PCR实验证实，sRANK可显著抑制甲状旁腺激素刺激的小鼠骨髓细胞碳酸苷酶Ⅱ和抗酒石酸酸性磷酸酶mRNA的表达。结果表明，sRANK具有抗骨吸收功能，可能成为一种治疗以骨吸收加强为特征的骨疾病的新方法。许多荣等^[22]探讨甲状旁腺激素在体外直接对破骨细胞分化及骨吸收能力的影响，以及其与成骨细胞中RANK基因和护骨素基因表达的关系，体外直接用甲状旁腺激素诱导C3h小鼠全骨髓分化出破骨细胞，用牙片小坑法(pits assay)观察破骨细胞对骨的重吸收能力，并采用多重RT-PCR方法检测在不同甲状旁腺激素作用浓度和不同作用时间的条件下，成骨细胞中核因子κB受体活化因子配体(RANKL)基因和护骨素基因的表达情况。结果显示甲状旁腺激素在体外可诱导C3h小鼠全骨髓分化出破骨细胞，且在一定浓度范围内，随着甲状旁腺激素增加，破骨细胞的形成数目和骨组织的破坏程度随之增加；在一定甲状旁腺激素浓度和时间范围内，成骨细胞中的核因子κB受体活化因子配体(RANKL) mRNA及骨保护素mRNA表达呈剂量依赖性和时间依赖性，说明甲状旁腺激素在体外可通过诱导核因子κB受体活化因子配体(RANKL)基因和骨保护素基因表达而直接影响破骨细胞的分化和骨重吸收功能。王晓敏等^[23]观察白细胞介素4对诱导骨髓干细胞分化形成破骨细胞的作用，用终浓度为10^-8 mol/L的1，25(OH)₂D₃诱导成年小鼠骨髓干细胞分化形成破骨细胞,在此过程中加入不同质量浓度梯度的白细胞介素4，结果显示白细胞介素4具有抑制骨髓干细胞分化形成破骨细胞的作用，这种作用不是通过使其他细胞形成可溶性因子，可能是直接作用于靶细胞(能分化为破骨细胞和巨噬细胞的前体细胞)，使定向分化为TRAP阳性单核细胞的前体细胞转向分化为巨噬细胞，破骨细胞数目减少，从而抑制了骨吸收。张睿^[24]选用4周龄SD雄性大鼠，利用全骨髓细胞培养系进行体外破骨细胞诱导培养，观察巨噬细胞集落刺激因子、核因子κB受体活化因子配体(RANKL)和1,25-(OH)₂D₃对破骨细胞形成及分化的影响，同时比较3种细胞因子的作用。结果显示巨噬细胞集落刺激因子、核因子κB受体活化因子配体(RANKL)和1，25-(OH)₂D₃对破骨细胞的形成和分化均具有促进作用。单因子和双因子间对破骨细胞形成和分化有显著性差异。

1，25-(OH)₂D₃是体内生物活性最强的维生素D活性形式，通过对成骨细胞和破骨细胞的作用，参与骨形成和骨吸收的代谢调节。张鲲等^[25]比较分析直接分离培养的Wistar大鼠破骨细胞和诱导培养的Wistar大鼠破骨样细胞的形态和功能的差异，采用两种培养法，即从新生(24 h内)的Wistar大鼠的四肢长骨骨髓腔内壁机械分离成熟破骨细胞直接培养和10^-8 mol/L的1，25-(OH)₂D₃诱导4周龄Wistar大鼠骨髓单核细胞形成破骨样细胞的方法，结果两种方法都培养出了抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性的多核细胞，诱导法获得的破骨细胞数量较多(P < 0.05)，成熟破骨细胞与诱导获得的破骨样细胞形态特征相似，但后者在骨片上形成的陷窝较小而浅，说明直接分离培养法可获得骨吸收功能较活跃的破骨细胞，但数目较少，适合骨吸收功能分析、破骨迁移黏附、凋亡研究及单细胞分子生物学研究，而1，25-(OH)₂D₃诱导鼠骨髓单核细胞形成的破骨样细胞数量较多，但骨吸收功能较差，适合用于破骨细胞分化发育过程的研究。

本实验1，25-(OH)₂D₃作用于成骨细胞上的受体，使核因子κB受体活化因子配体(RANKL)生成增加，骨保护素生成减少，当RANKL与破骨前体细胞(骨髓单核细胞)的核因子κB受体活化因子(RANK)结合，则促进破骨细胞分化形成。0.05%胰蛋白酶-0.02% EDTA联合将贴壁能力较弱的单核细胞消化下来，留下了贴壁能力较高的破骨细胞，又将消化下来的单核细胞进行诱导，由于大鼠骨髓单核细胞数量巨大，诱导产生的破骨样细胞数量也较多。破骨样细胞与破骨细胞产生的破骨细胞形态、特异酶均相同，并且数量较多，产生的破骨样细胞在体外与骨片共培养具有噬骨能力，是一种具有与原代破骨细胞一样能力的破骨样细胞。

由于骨髓干细胞1，25-(OH)₂D₃诱导培养体系需要成骨细胞支持，造成破骨细胞分离纯化困难，所以这种方法比较适用于研究破骨细胞分化发育过程中细胞因子的调节作用，而不适合用于对细胞纯度要求较高的破骨细胞分泌蛋白检测、生化和分子生物研究等。本研究显示这种破骨样细胞能够形成骨陷凹，与直接机械分离培养的破骨细胞形成的骨陷凹面积和深度相当，所以认为诱导形成的破骨样细胞破骨能力，与直接分离培养的成熟破骨细胞大致相同。